Los científicos utilizan varias técnicas de biología molecular para analizar el ADN. En este artículo, he resumido algunos de ellos para que puedas comprender mejor los principios generales y los pasos involucrados en su funcionamiento.
Enzimas de restricción y clonación molecular
Se pueden hacer muchas copias de un gen de interés aislando el gen, colocándolo en una bacteria y luego cultivando la bacteria. A medida que la bacteria crece, también replicará el gen de interés. A continuación, se puede aislar el gen de interés o su producto proteico. Se usa una enzima de restricción para cortar el gen de interés del ADN. Después de eso, se corta un plásmido bacteriano que contiene un biomarcador con la misma enzima de restricción. El corte tanto en el ADN original como en el plásmido tiene salientes o “extremos pegajosos” que se complementan entre sí. En el siguiente paso, se unen para formar un plásmido recombinante. Este plásmido luego se coloca en bacterias mediante un proceso llamado transformación. A medida que la bacteria crece, el gen de interés se replica y luego se puede aislar.
Clonación Molecular Usando PCR
En los casos en los que se dispone de una pequeña cantidad de ADN, el uso de la PCR para la clonación es un mejor enfoque. Este método no necesita enzimas de restricción. El proceso implica la rápida amplificación del gen de interés en los primeros pasos, seguido de la ligadura en un vector (plásmido) como se indicó anteriormente. Luego, el vector puede colocarse en bacterias y luego crecer para replicar el gen de interés.
Bibliotecas de ADN
Una biblioteca de ADN es una colección de fragmentos de ADN que representan el genoma completo de un organismo. El ADN se almacena en una población de vectores idénticos, cada uno con un fragmento de ADN. Se construye extrayendo primero el ADN y luego digiriéndolo con enzimas de restricción para formar muchos fragmentos. Luego, los fragmentos se insertan en un vector (plásmido) y luego se transfieren a un huésped como E. coli para su amplificación. Usando esta biblioteca, los científicos pueden aislar y estudiar colonias específicas que tienen los genes que les interesa estudiar.
Transferencia del Sur
La transferencia Southern es una técnica utilizada para detectar una secuencia específica de ADN en una mezcla compleja. El proceso comienza cortando el ADN en fragmentos usando enzimas de restricción y luego separando los fragmentos por tamaño usando electroforesis en gel. Luego se usa un álcali suave (NaOH) para desnaturalizar el ADN, transformándolo de doble cadena a cadena simple. Luego, el ADN se transfiere a una membrana de nailon o nitrocelulosa, después de lo cual se agrega una sonda. Dado que las sondas son complementarias al gen de interés, solo esos genes se hibridarán. Luego, los genes hibridados se pueden visualizar mediante autorradiografía, fluorescencia o cambio de color, según el tipo de sonda utilizada.
Transferencia del norte
La transferencia Northern determina la presencia de ARN, que en última instancia indica si se expresa un gen. El primer paso es extraer el ARN y desnaturalizarlo con formaldehído para eliminar el apareamiento de bases (recuerde que el ARN, aunque es monocatenario, puede aparearse consigo mismo). Luego, el ARN se separa mediante electroforesis en gel, se transfiere a una membrana y luego se trata con una sonda radiactiva. La sonda se une al ARN de interés y se puede visualizar mediante un método autorradiográfico.
Secuenciación de Sanger
La secuencia de Sanger es un método que se utiliza para determinar la secuencia de letras en el ADN. Durante el proceso, tanto los desoxinucleótidos (dNTP) como los didesoxinucleótidos (ddNTP) son incorporados por la ADN polimerasa al ADN que se va a copiar. Dado que los ddNTP carecen de un grupo hidroxilo en el extremo 3′, la terminación se produce cuando se agregan. Esto crea fracciones de diferentes tamaños, en las que el último nucleótido de cada fragmento representa un ddNTP. A continuación, las fracciones se pueden separar mediante electroforesis. Dado que se conoce la última letra de cada fragmento, se puede determinar la secuencia correcta leyendo el gel de abajo hacia arriba (del fragmento más pequeño al más grande). Estos son los pasos clave en el proceso:
- Amplificar el ADN usando PCR
- Agregue ADN amplificado en un recipiente de reacción que contenga
- Cebador
- ADN polimerasa
- Los cuatro nucleótidos normales (A, T, G y C)
- Pequeñas concentraciones de los cuatro nucleótidos modificados ligados a la sonda (ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP)
- Permita que la ADN polimerasa copie el ADN en el recipiente de reacción
- Separar los fragmentos resultantes por electroforesis.
- Escriba la secuencia leyendo el gel de abajo hacia arriba
Courtney Simons
Administrador
Courtney Simons es profesora de ciencias de la alimentación. Tiene una licenciatura en ciencias de los alimentos y un doctorado. en ciencias de los cereales de la Universidad Estatal de Dakota del Norte.